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Laboratorio di Biologia e Fisiologia Sperimentale  

Lab. Limonta

 

Linee di ricerca

Il tema delle linee di ricerca del Laboratorio è costituito dall’analisi delle basi  molecolari/cellulari del processo neoplastico. In particolare il Laboratorio si occupa della espressione di alcuni recettori ormonali e del loro ruolo nei meccanismi molecolari di controllo della crescita e della progressione dei tumori. Scopo ultimo delle ricerche è quello di individuare nuovi markers biologici e, quindi, targets molecolari, per lo sviluppo di nuove terapie antitumorali. 

Ruolo del GnRH e del suo recettore nel controllo della crescita e della progressione del tumore prostatico

Il tumore della prostata è la seconda causa di morte per cancro nei paesi occidentali. Il tumore si presenta inizialmente con caratteristiche di androgeno-dipendenza; la terapia d’elezione è rappresentata dagli analoghi agonisti del Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH, ormone di rilascio delle gonadotropine) che inducono un blocco dell’asse ipofisi-gonadi e, quindi, della produzione di testosterone. Tuttavia, dopo una fase iniziale di regressione, il tumore riprende a svilupparsi con caratteristiche di androgeno-indipendenza. Le opzioni terapeutiche del tumore prostatico androgeno-indipendente sono tuttora limitate.

Studi condotti nel Laboratorio hanno dimostrato che i recettori per il GnRH sono espressi non solo in cellule ipofisariche, ma anche nel tumore prostatico, sia a livello di mRNA che di proteina. L’attivazione di questi recettori, ottenuta mediante analoghi agonisti dell’ormone, riduce in modo significativo  la proliferazione cellulare, sia in vitro che in vivo (in topi nudi con xenografts di cellule tumorali prostatiche umane), così come il  comportamento migratorio ed invasivo delle cellule tumorali prostatiche; questa azione è mediata da una riduzione dell’espressione e/o attività di molecole coinvolte nel comportamento metastatico delle cellule tumorali (integrine e metalloproteasi della matrice). Gli agonisti del GnRH agiscono  interferendo con l’azione mitogenica e pro-metastatica di fattori di crescita, quali EGF ed IGF-I, bloccando le vie di trasduzione del segnale associate ai loro recettori tirosino-chinasici. Dal momento che questi composti agiscono su cellule tumorali prostatiche sia androgeno-dipendenti che androgeno-indipendenti (resistenti alla castrazione), i risultati ottenuti da questi  studi suggeriscono che essi possano esercitare un’azione antitumorale diretta sul carcinoma prostatico anche nelle sue fasi di maggiore aggressività. Dati recenti dimostrano infine che gli agonisti del GnRH sono in grado di sensibilizzare e ri-sensibilizzare ai citotossici cellule diventate resistenti all'azione apopototica della chemioterapia.

Ruolo del GnRH e del suo recettore nel controllo della crescita e della progressione del melanoma

Il melanoma cutaneo è un tumore caratterizzato da crescita molto rapida e dalla precoce acquisizione di elevate proprietà metastatiche. Le opzioni terapeutiche del melanoma sono tuttora molto limitate. Studi condotti dal Laboratorio hanno dimostrato che i recettori per il GnRH sono espressi su cellule di melanoma (derivate da pazienti  in fasi diverse della progressione della patologia), un tumore classicamente non correlato al sistema riproduttivo. L’attivazione di questi recettori riduce significativamente sia la proliferazione che il comportamento metastatico delle cellule tumorali.  Questo effetto è accompagnato da una riduzione dei livelli di espressione della subunità integrinica a3 e dell’attività della metalloproteasi della matrice-2. Esperimenti di analisi di espressione genica (studi di microarray eseguiti mediante Affymetrix Human Genome U133 plus 2.0 Array) hanno evidenziato che l’attivazione dei recettori del GnRH riduce in modo significativo l’espressione del fattore proangiogenico VEGF. Queste osservazioni sono state successivamente confermate mediante Real Time-PCR e dosaggio ELISA del VEGF secreto dalle cellule. Inoltre, il recettore per il GnRH è espresso anche in cellule endoteliali di vena ombelicale umana (HUVEC) e la sua attivazione contrasta l'azione proangiogenica del VEGF. Quindi, l’attivazione dei recettori del GnRH  riduce non solo la crescita ed il comportamento metastatico del melanoma, ma anche le sue proprietà proangiogeniche.

Considerati nel loro insieme, questi risultati indicano che il recettore per il GnRH possa essere considerato un nuovo target  molecolare per lo sviluppo di nuove terapie per il trattamento del melanoma.

Ruolo delle due differenti isoforme di clusterina nel processo della tumorigenesi prostatica

La clusterina è una glicoproteina eterodimerica, altamente glicosilata, che è espressa in diversi tessuti dove è coinvolta nel controllo di numerose funzioni biologiche. Oltre a questa isoforma, chiamata sCLU in quanto viene secreta dalle cellule, è stata identificata una forma più corta, che manca del peptide segnale e, quindi, non entra nel reticolo endoplasmatico e viene destinata al nucleo. nCLU deriverebbe da splicing alternativo o da traduzione alternativa  dell’RNA della clusterina. Ricerche condotte nel Laboratorio, mediante esperimenti di iperesressione,  hanno dimostrato che  l’isoforma nCLU è responsabile di una significativa azione proapoptotica ed antimetastatica, sia in cellule prostatiche  epiteliali nontumorali che in cellule tumorali. sCLU, invece, è proapoptotica ed antimetastatica in cellule normali ma non in quelle tumorali. Per comprendere le cause del diverso ruolo delle due isoforme di CLU, si è ipotizzato che la proteina possa andare incontro ad un diverso pattern di  espressione in cellule normali o tumorali. Nel Laboratorio si è infatti verificato che, dopo iperespressione del gene della forma intera di CLU, nelle cellule normali si formano sia sCLU che nCLU, mentre nelle cellule tumorali si forma solo sCLU. Ciò indica che le  cellule tumorali perdono i meccanismi che portano alla formazione dell’isoforma proapoptotica. Questi risultati  dimostrano che il pattern di produzione delle due isoforme di clusterina possa giocare un ruolo cruciale nel processo di tumorigenesi della prostata.

Basi molecolari per lo sviluppo di strategie chemiopreventive e terapeutiche innovative nel melanoma: ruolo del recettore estrogenico beta e tocotrienoli

Come già sottolineato, sulla base dell’aumentata incidenza del melanoma, la prognosi negativa e gli scarsi risultati ottenuti con le terapie farmacologiche in uso (interferone-a, dacarbazina, IL-2, ecc.), emerge in maniera evidente come sia fondamentale l’identificazione di nuovi marcatori molecolari per il miglioramento della diagnosi e lo sviluppo di strategie più efficaci e meno tossiche

Differenti osservazioni sperimentali indicano che il recettore estrogenico beta( ERb) è associato ad attività antitumorale, sulla base di  rapporti clinici che dimostrano che ERb, ma non ERa, rappresenta il principale recettore estrogenico espresso in lesioni melanocitiche e la sua espressione diminuisce in modo significativo durante la progressione del tumore. Inoltre,  è noto che i nutraceutici possono esercitare uno specifico effetto antitumorale non solo sulla base delle loro proprietà antiossidanti ma anche sulla base della loro capacità di interferire con i processi molecolari coinvolti nello sviluppo delle neoplasie.

Dati preliminari ottenuti nel laboratorio indicano che il recettore estrogenico beta è espresso in cellule di melanoma umano e la sua attivazione induce riduzione della proliferazione cellulare. Inoltre, i tocotrienoli, derivati della vitamina E, sono in grado di esercitare un effetto antiproliferativo su cellule di melanoma, attraverso l'attivazione di ERb. Studi sono in corso per chiarire i meccanismi molecolari dell'azione antitumorale  di ERb nel melanoma e della sua interazione con i tocotrienoli. Scopo di queste ricerche è quello di individuare nuove strategie terapeutiche e/o chemiopreventive in questo tumore ancora purtroppo incurabile.

 

Tecniche

Colture cellulari

Metodi di valutazione di crescita, motilità e invasività cellulare: conta cellulare, MTT, camera di Boyden , test di adesione e invasione

Test clonogenico

Metodi di valutazione del comportamento angiogenico: formazione di tubuli endoteliali

Gel elettroforesi: western blot , immunoprecipitazione e zimografia

Immunofluorescenza

RT-PCR e real time PCR

Tecniche del DNA ricombinante

Silenziamento genico (RNA interference)

 

Selezione pubblicazioni

1. Limonta P, Montagnani Marelli M, Mai S, Motta M, Martini L, Moretti RM (2012) GnRH receptors in cancer: from cell biology to novel targeted therapeutic strategies. Endocr Rev33:784-811.

2. Moretti RM, Mai S, Montagnani Marelli M, Rizzi F, Bettuzzi S, Limonta P (2011) Molecular mechanisms of the antimetastatic activity of nucelar clusterin in prostate cancer cells. Int J Oncol39:225-34.

3. Moretti RM, Mai S, Montagnani Marelli M, Bani MR, Ghilardi C, Giavazzi R, Taylor DM, Martini PG, Limonta P (2010) Dual targeting of tumor and endothelial cells by gonadotropin- releasing hormone agonists to reduce melanoma angiogenesis. Endocrinology151:4643-53.

4. M. Montagnani Marelli M, R.M. Moretti  RM, S. Mai S, J. Januszkiewicz-Caulier J, M. Motta M, P. Limonta P (2009) Type I gonadotropin-releasing hormone  receptor mediates the  antiproliferative

effects of GnRH-II on prostate cancer cells. J Clin Endocrinol Metab94:1761-67.

5. Moretti RM, Montagnani Marelli M, Mai S, Cariboni A, Scaltriti M, Bettuzzi S, Limonta P (2007) Clusterin isoforms differentially affect growth and motility of prostate cells: possible implications in prostate tumorigenesis. Cancer Res67:10325-33.

6. Montagnani Marelli M,  Moretti RM, Junuszkiewicz-Caulier J,  Motta M, Limonta P (2006) Gonadotropin.-Releasing Hormone (GnRH) receptors in tumors: a new rationale for the therapeutic application of GnRH analogs in cancer patients. Current Cancer Drug Target 6:257-269.

7. Montagnani Marelli M, Moretti RM,  Procacci P, Motta M, Limonta P (2006) Insulin-like growth factor-I promotes migration in human androgen-independent prostate cancer cells via the alphavbeta3 integrin and PI3/Akt signaling. Int J Oncol28:723-30.

8. Limonta P, Moretti RM, Montagnani Marelli M, Motta M (2003) The biology of gonadotropin hormone- releasing hormone: role in the control of tumor growth and progression in humans. Front Neuroendocrinol    24:279-95.

9. Moretti RM, Montagnani Marelli M, van Groeninghen JC, Motta M, Limonta P (2003) Inhibitory activity of luteinizing hormone-releasing hormone on tumor growth and progression. Endocr-Relat Cancer10:161-167.

10. Moretti RM, Montagnani Marelli M, Groeninghen JC, Limonta P (2002) Locally expressed luteinizing hormone-releasing hormone (LHRH) receptors mediate the oncostatic and antimetastatic activity of LHRH agonists on melanoma cells. J Clin Endocrinol Metab87:3791-97.

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