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Laboratorio di Farmacologia Cellulare dell’Aterosclerosi  

Lab. Corsini

 

Linee di ricerca

L’interesse del gruppo di ricerca è focalizzato sulla fisiopatologia, biochimica e regolazione farmacologica dell’aterosclerosi ed altre patologie specie cardiovascolari. Possiede esperienza in studi molecolari e farmacologici, biologia di cellule vascolari, processi infiammatori, biochimica dei lipidi e lipoproteine.

Studio del ruolo della pro-proteina convertasi subtilisina/kexina di tipo 9 (PCSK9) rilasciata da cellule muscolari lisce sull’aterogenesi
La pro-proteina convertasi subtilisina/kexina di tipo 9 (PCSK9) è un importante regolatore del recettore delle lipoproteine a bassa densità (LDL) e dei livelli di colesterolo. Sebbene PCSK9 sia principalmente di origine epatica, abbiamo recentemente documentato che è anche secreto da cellule muscolari lisce (CML) presenti nella parete vasale ed è rilevabile in placche aterosclerotiche umane. Mediante l’utilizzo di cellule in coltura in vitro abbiamo dimostrato che PCSK9, secreto dalle CML, riduce i livelli del LDLR nei macrofagi. Inoltre, dati preliminari indicano che il PDGF induce PCSK9, e che PCSK9 è coinvolta nella migrazione delle CML. Da queste evidenze è possibile speculare che PCSK9, espresso localmente nella placca aterosclerotica, può giocare un ruolo chiave nell’aterogenesi. Nel presente progetto noi definiremo, mediante approcci sperimentali in vitro ed in vivo, il ruolo di PCSK9 nell’aterogenesi e patologie cardiovascolari correlate.

Progettazione e sintesi di nuovi inibitori della proteina Rac1 e loro valutazione farmacologica nell'ambito della terapia cardiovascolare
Le proteine monomeriche Rho sono coinvolte nella regolazione di molteplici funzioni cellulari e, come recentemente mostrato, anche nella patogenesi di malattie cardiovascolari e dei tumori. Diverse evidenze mostrano che le proteine Rho giocano un ruolo fondamentale nella patogenesi dell'aterosclerosi, supportando così l'idea che le Rho possano essere potenziali bersagli farmacologici per le malattie cardiovascolari. Recentemente, partendo da informazioni strutturali sulla Rac1 e usando un metodo di virtual screening abbiamo identificato cinque nuovi inibitori di Rac1. In questo progetto ci prefiggiamo di ottenere tramite ricerche di similarità un adeguato numero di composti da valutare farmacologicamente e così condurre una analisi delle relazioni struttura attività (SAR) con conseguente ottimizzazione molecolare. I composti identificati saranno sottoposti a numerosi saggi biologici in vitro in modo da ottenere una completa informazione circa i profili farmacologici e tossicologici dei nuovi composti. Infine, i migliori candidati farmaco, selezionati tramite i saggi in vitro, verranno sottoposti ad uno studio in vivo, di ipertrofia cardiaca in uno specifico modello animale. I risultati ottenuti permetteranno una descrizione sufficientemente completa della potenzialità di uso dei nuovi composti nella terapia dell'aterosclerosi.

Progettazione e sintesi di nuovi inibitori della proteina STAT3 e loro valutazione farmacologica
Il progetto di ricerca riguarda la sintesi, l'analisi strutturale, la valutazione biologica e la comprensione del meccanismo d'azione di nuovi composti, quali potenziali agenti antitumorali in grado di inibire STAT3 (Signal Transducer and Activator of Transcription Protein), fattore coinvolto nella progressione e metastasi di numerose forme tumorali. Recentemente abbiamo identificato un derivato ossadiazolico (MD77) come potenziale lead, in grado di inibire in modo dose-dipendente l'attività di STAT3 (saggio della dual-luciferasi in cellule HCT-116) e di legarsi al dominio SH2 (AlphaScreen-based assay). Inoltre il composto ha dimostrato interessante attività antiproliferativa su 58 linee cellulari umane, derivate da 9 diversi tipi di cellule tumorali. Lo scopo del progetto è ottenere dati SAR utili all'identificazione ed ottimizzazione del farmacoforo, per il possibile sviluppo di nuovi farmaci antitumorali, caratterizzati da alta selettività e bassa tossicità. Parallelamente, visti gli incoraggianti risultati ottenuti sia in vitro che in vivo con complessi di platino quali inibitori diretti e selettivi di STAT3, verrà valutata la possibilità di introdurre una metilammina in posizione 4 di MD77 per consentire la coordinazione al metallo e ci si occuperà della progettazione di nuovi complessi di platino aventi leganti eterociclici opportunamente sostituiti. La valutazione biologica e lo studio del meccanismo d'azione verranno eseguiti presso il nostro laboratorio.

Fumo di sigaretta e aterogenesi: il ruolo di monociti/macrofagi
I monociti/macrofagi sono fondamentali per l'inizio e la progressione dell'aterosclerosi. I monociti nella parete arteriosa in presenza di citochine differenziano in macrofagi attivati e aumentano l’espressione di recettori scavenger che mediano l’internalizzazione di lipoproteine a bassa densità modificate portando alla formazione di cellule schiumose. Anche se è stato dimostrato che il fumo di sigaretta è uno dei principali fattori di rischio per l’aterosclerosi e le patologie cardiovascolari correlate, non è ben chiaro quali siano i meccanismi alla base dei suoi effetti nocivi e quale componente del fumo giochi il principale ruolo patologico nella malattia. In particolare, non è chiaro come il fumo di sigaretta possa influenzare l'espressione di fattori infiammatori come le citochine e il reclutamento dei macrofagi nelle lesioni aterosclerotiche. I nostri studi si prefiggono di valutare gli effetti del fumo di sigaretta sulle funzioni di monociti/macrofagi nel processo aterosclerotico. Utilizzeremo monociti e cellule endoteliali umane per caratterizzare gli effetti degli estratti del fumo di sigaretta sul processo di adesione dei monociti e la loro transmigrazione attraverso un monostrato di cellule endoteliali, sulla espressione di citochine proinfiammatorie e di metalloproteinasi e sull’accumulo di lipidi intracellulari.

L’accumulo di colesterolo induce la transdifferenziazione delle cellule muscolari lisce in macrofagi
Nei primi momenti della formazione della placca aterosclerotica, le cellule della parete vasale, come i macrofagi, accumulano colesterolo libero ed esterificato trasformandosi in cellule schiumose. Anche se si pensa che la maggioranza di queste cellule schiumose derivi dai macrofagi, alcune potrebbero originare dalle cellule muscolari lisce (CML). E’ stato dimostrato che CML caricate di colesterolo assumono un aspetto tipo le cellule schiumose e perdono la capacità di esprimere dei markers caratteristici delle CML. Lo scopo del nostro studio è quello di caratterizzare ulteriormente il processo di transdifferenziazione delle CML a macrofago. CML isolate dall’aorta di topi normali e caricate con colesterolo libero complessato con metil-beta-ciclodestrina, assumono rapidamente l’aspetto di cellule schiumose, perdendo la capacità di esprimere dei marker di CML, tipo alfa-actina, e aumentano l’espressione di marker tipici dei macrofagi come Mac-2, e di ABCA1, ABCG1 ed SRBI. Stiamo valutando il ruolo di ABCA1, ABCG1 e delle HDL3 nella modulazione di questi processi, sia in CML isolate da topi normali sia da topi che non esprimono ABCA1.

Effetto di due diversi regimi terapeutici con everolimus sul profilo lipidico-lipoproteico plasmatico e su marcatori di infiammazione in pazienti che hanno subito trapianto cardiaco
L’iperlipidemia, una delle maggiori complicazioni dopo trapianto d’organo, contribuisce in modo determinante allo sviluppo di aterosclerosi. Purtroppo, tale effetto è esacerbato da farmaci immunosoppressori quali gli inibitori di mTOR e, nonostante una serie di evidenze, il meccanismo di questa dislipidemia non è ancora chiarito. Siccome l’inibitore di mTOR everolimus è utilizzato con successo, in combinazione con basse dosi di ciclosporina, nella prevenzione del rigetto acuto d’organo, proponiamo in questo progetto di studiare la dislipidemia in campioni plasmatici prelevati da pazienti che hanno appena subito un trapianto cardiaco, trattati con ciclosporina, steroidi, everolimus (immediatamente al trapianto o dopo 4-6 settimane con mofetil micofenolato) e fluvastatina come ipolipidemizzante. Su questi campioni, prelevati al trapianto e dopo 1, 3 e 6 mesi, oltre a seguire l’andamento tempo-dipendente dalla dislipidemia indotta dal trapianto, verificheremo l’effetto sul metabolismo lipidico da parte di everolimus e fluvastatina, mediante determinazione: a) dei lipidi plasmatici (colesterolo totale, HDL, LDL, non-HDL, trigliceridi), del profilo e del contenuto lipidico delle lipoproteine (VLDL, LDL, HDL), b) delle concentrazioni delle apolipoproteine (apoB, apoA-I, apoC-II), c) dell’attività della CETP e d) di marcatori di infiammazione (CD40L, metalloproteasi della matrice), mediante tecniche cromatografiche e colorimetriche. I risultati del presente studio potranno essere utili per cercare di comprendere i meccanismi di questa dislipidemia e di documentare l’efficacia della terapia farmacologica con everolimus e fluvastatina nei pazienti sottoposti a trapianto cardiaco.

Ibridi NO donatori/antiossidanti come nuove molecole ateroprotettive. Effetti in vitro sulla proliferazione dei cellule muscolari lisce
L’aterosclerosi è un processo multifattoriale, in cui l’ossidazione delle LDL, la diminuita biodisponibilità di NO e l’iperproliferazione delle cellule muscolari lisce giocano ruoli essenziali. Allo scopo di identificare un nuovo approccio per controllare l’aterosclerosi, abbiamo sintetizzato molecole NO-donatrici (furossani) che si sono dimostrate in grado di rilasciare strisce di aorta di ratto in modo NO-dipendente. Abbiamo quindi unito queste molecole con diverse porzioni antiossidanti, per generare ibridi antiossidanti-NO donatori e ne abbiamo valutato la loro capacità antiproliferativa. Sebbene con potenze diverse, questi composti inibiscono la crescita cellulare bloccando specificamente la transizione G1/S del ciclo. Per comprendere il meccanismo d’azione del loro effetto antiproliferativo, abbiamo analizzato separatamente i due farmacofori, documentando come il furossano fosse il solo responsabile di tale attività. Abbiamo dimostrato come sia la potenza di inibizione della proliferazione sia quella di vasodilatazione correlino con la capacità elettronattrattrice del gruppo in posizione 3 dell’anello eterociclico e come l’apertura di questo anello sia essenziale per l’effetto antiproliferativo. Quest’ultima proprietà non è mediata nè da cGMP, nè dalle poliammine, ovvero dalle due vie metaboliche coinvolte negli effetti antiproliferativi NO-dipendenti, suggerendo per NO un ruolo da comprimario. Attualmente stiamo effettuando esperimenti per comprendere il meccanismo d’azione di queste molecole mediante diversi approcci di proteomica: tali risultati potranno far sì che i furossani, grazie alle loro proprietà farmacologiche modulabili (es. NO-donazione, inibizione della crescita cellulare) potranno essere utilizzati, assieme ad altri farmacofori, nella sintesi di farmaci ibridi disegnati per prevenire o curare svariate patologie.

 

Tecniche

Il laboratorio dispone di un laboratorio per colture cellulari completamente attrezzato per l’isolamento ed il mantenimento di linee cellulari primarie e continue. Il laboratorio è inoltre equipaggiato con un termociclatore per RT-PCR quantitativa ABI Prism 7000 (Applied Biosystem), un gas-cromatografo automatizzato (DANI GC 1000, Milan, Italy), un sistema HPLC (Jasco), un Coulter counter per il conteggio cellulare, e il sistema iCELLigence per il monitoraggio in tempo reale del comportamento cellulare.

Tecniche sperimentali in vitro:

Saggi di proliferazione cellulare mediante il conteggio delle cellule con il Coulter counter e con il sistema iCELLigence.

Saggio di chemotassi con la Camera di Boyden, valutazione della transmigrazione cellulare.

Analisi di Western blot e zimografia.

Saggi ELISA, EIA e G-LISA.

Analisi quantitative RT-PCR.

Sovraespressione genica e silenziamento in cellule vascolari primarie (cellule muscolari lisce, macrofagi, e cellule endoteliali) mediante vettori retrovirali e siRNA.

Tecniche sperimentali In vivo:

Insulto vascolare mediante posizionamento perivascolare carotideo di un collarino non-occlusivo in conigli e topi.

Ipertrofia cardiaca mediante infusion di Ang-II con pompe osmotiche  

Altre tecniche sperimentali

Lipidomica (TLC, GLC, HPLC) di lipidi semplici e complessi derivati da diverse matrici (cellule, medium, tessuti, plasma, lipoproteine).

 

Selezione pubblicazioni

Ferri N, Tibolla G, Pirillo A, Cipollone F, Mezzetti A, Pacia S, Corsini A and Catapano AL. (2012) Proprotein convertase subtilisin kexin type 9 (PCSK9) secreted by cultured smooth muscle cells reduces macrophages LDLR levels.. Atherosclerosis. 220(2):381-6.

Bellosta S, Corsini A. (2012) Statin drug interactions and related adverse reactions. Expert Opinion On Drug Safety11(6):933-46.

Arnaboldi L, Corsini A. (2010) Do structural differences in statins correlate with clinical efficacy? Curr Opin Lipidol. 21(4):298-304

Ferri N, Corsini A, Bottino P, Clerici F, and Contini A.  (2009) Virtual screening approach for the identification of new classes of Rac1 inhibitors. J Med Chem. 52(14):4087-90.

Arnaboldi L, Guzzetta M, Pazzucconi F, Radaelli G, Paoletti R, Sirtori CR, Corsini A. (2007) Serum from hypercholesterolemic patients treated with atorvastatin or simvastatin inhibits cultured human smooth muscle cell proliferation. Pharmacol Res. 56(6):503-8.

Rizki G, Arnaboldi L, Gabrielli B, Yan J, Lee GS, Ng RK, Turner SM, Badger TM, Pitas RE, Maher JJ. (2006) Mice fed a lipogenic methionine-choline-deficient diet develop hypermetabolism coincident with hepatic suppression of SCD-1. J Lipid Res. 47(10):2280-90.

Gizard F, Amant C, Barbier O, Bellosta S, Robillard R, Percevault F, Sevestre H, Krimpenfort P, Corsini A, Rochette J, Glineur C, Fruchart J-C, Torpier G, Staels B. (2005) PPARalpha inhibits vascular smooth muscle cell proliferation underlying intimal hyperplasia by inducing the tumor suppressor gene p16INK4a. J Clin Invest115:3228-3238. 

Ferri N, Carragher NO, Raines EW. (2004) Role of Discoidin Domain Receptor 1 and 2 in human smooth muscle cell-mediated collagen remodeling: potential implications in lesions of atherosclerosis and lymphangioleimyomatosis. Am. J Pathol164(5):1575-1585.

Bellosta S, Paoletti R, Corsini A. (2004) Safety of statins: Focus on clinical pharmacokinetics and drug interaction. Circulation109(23 Suppl 1):III50-57.             

Bellosta S, Via D, Canavesi M, Pfister P, Fumagalli R, Bernini F. (1998) HMG-CoA reductase inhibitors reduce MMP-9 secretion by macrophages. Arterioscl. Thromb. Vasc. Biol. 18:1671-1678.     

 

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