La Piattaforma di Sequenziamento di Nuova Generazione (NGS) del Dipartimento di Scienze Farmacologiche e Biomolecolari (DISFeB) è stata creata nell’ambito del Progetto di Eccellenza 2018-2022. Questa Piattaforma Tecnologica è costituita da due sequenziatori per DNA di Illumina e da un sistema di elettroforesi automatizzata per acidi nucleici dell’Agilent Technologies:

1. Il sistema Agilent 4200 TapeStation è uno strumento di elettroforesi automatica per il controllo della qualità dei campioni di DNA e RNA. L'elaborazione completamente automatizzata del campione consente l'analisi in contemporanea della dimensione, concentrazione e integrità degli acidi nucleici di 96 campioni, permettendo quindi il controllo della qualità dei campioni all'interno dei flussi di lavoro di NGS.
Il sistema copre l'intera gamma dimensionale di DNA e RNA e offre alti livelli di flessibilità associati ad un flusso di lavoro semplificato.
Aspetti principali:
• L’analisi di ciascuno campione dura solo 1 o 2 minuti (meno di 90 minuti per 96 campioni).
• Richiede volumi ridotti di campione di DNA o RNA (1-2 µL), anche per analisi ad alta sensibilità.
• Fornisce le dimensioni, la concentrazione e gli standard di integrità dell'RNA (RNA integrity number equivalent, RINe) e del DNA genomico (DNA Integrity Number, DIN).

2. Il sistema MiSeq Illumina è un sistema NGS da banco dotato di un flusso di lavoro semplice che permette di sequenziare il campione in appena otto ore. Capace di generare fino a 15 Gb di dati per corsa, il sistema MiSeq è l'unico sequenziatore di nuova generazione che integra le funzioni di amplificazione, sequenziamento e analisi dei dati in un unico strumento con un ingombro ridotto.
Applicazioni:
• Sequenziamento di ampliconi da PCR
• Sequenziamento sonde di inversione molecolare
• Sequenziamento de novo
• Sequenziamento mate pair per librerie con dimensioni di inserti di 2-5 kb
• ChIP-Seq di proteine che legano il DNA in regioni specifiche
• ChIP-Seq delle modificazioni degli istoni ed epigenetiche
• Sequenziamento di DNA trattato con bisolfito per studiare la metilazione del DNA
• Metagenomica (sequenziamento dell'rRNA 16S)
• Sequenziamento dell'mRNA
• Espressione genica basata su marcatori
• Sequenziamento small RNA
• Profilo ribosomiale
• Tipizzazione HLA mediante sequenziamento
• Mappatura dei siti ipersensibili alla DNAsi 1
• Studi sulla struttura della cromatina e sul posizionamento dei nucleosomi
• ChIP-Seq: studio delle interazioni RNA/proteine specifiche
• CNV-Seq: misurazione della variazione del numero di copie con il sequenziamento
• GRO-Seq: studio degli eventi di innesco dell'RNA polimerasi
• Sequenziamento dei campioni di DNA
• Sequenziamento mRNA paired-end
• Espressione specifica di alleli di DNA

3. Il sistema NextSeq 550 Illumina è l’unico sistema da banco NGS in grado di effettuare il sequenziamento del genoma umano 30X in una sola corsa. Il flusso di lavoro semplice e di breve durata permette di ottenere il sequenziamento rapido di esomi, trascrittomi e genomi interi.
Il sistema NextSeq 550 è una piattaforma integrata che utilizza la tecnologia del sequenziamento massivo parallelo per l'analisi genetica e la genomica funzionale. Le librerie preparate vengono caricate direttamente sul sistema. La generazione di cluster integrata fornisce l'amplificazione clonale automatizzata di singole molecole distribuite su una superficie di vetro. I cluster di DNA così ottenuti sono sequenziati su NextSeq 550 utilizzando il metodo di sequenziamento mediante sintesi (SBS).
Il sistema consiste in un sequenziatore, che incorpora una cella a flusso per generare fino a 400 milioni di cluster (fino a 120 Gb) nella configurazione Output elevato e fino a 130 milioni di cluster fino a 40 Gb nella configurazione Output medio. Il sistema è in grado di interfacciarsi con l'ambiente di calcolo genomico BaseSpace, permettendo di archiviare, analizzare e condividere i dati genomici in modo facile, sicuro ed efficace sia sul cloud che in laboratorio (sistema BaseSpace Onsite). Al termine della scansione, viene generato un file di immagini che deve essere esportato su computer o cloud per l'analisi dei dati.
Applicazioni:
• Sequenziamento dell'intero genoma
• Sequenziamento mirato comprende, in via esemplificativa, i metodi seguenti:
o Esomi (37 Mb-62 Mb)
o Pannelli di arricchimento Custom (100 kb-Mb)
o Pannelli Custom Amplicon (100 kb)
• Sequenziamento de novo
• Sequenziamento mate pair per librerie con dimensioni di inserti di 2-5 kb
• ChIP-Seq di proteine che legano il DNA in regioni specifiche
• ChIP-Seq delle modificazioni degli istoni e segnali epigenetici
• Sequenziamento di DNA trattato con bisolfito per studiare la metilazione del DNA
• Sequenziamento mRNA
• Espressione genica basata su marcatori
• Sequenziamento small RNA
• Sequenziamento RNA totale (codificante + non codificante)
• Sequenziamento RNA target
• Profilo ribosomiale
• Tipizzazione di HLA basata sulla sequenza
• Mappatura dei siti ipersensibili alla DNAsi 1
• Studi sulla struttura della cromatina e sul posizionamento dei nucleosomi
• ChIP-Seq: studio delle interazioni RNA/proteine specifiche
• CNV-Seq: misurazione della variazione del numero di copie con il sequenziamento
• GRO-Seq: studio degli eventi di innesco dell'RNA polimerasi
• Sequenziamento mRNA paired-end per studiare le fusioni geniche nel cancro
• Screening prenatale da sangue materno
• Sequenziamento dei campioni di DNA antico
• Espressione specifica di alleli di DNA